nadph-细胞色素c还原酶试剂盒(微量法)

 注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR作为P450酶系的重要一员，催化氧化型P450还原再生。

测定原理：

NCR催化NADPH还原氧化型细胞色素C，还原型细胞色素C在550nm处有特征吸收峰；通过测定550nm吸光度的增加速率，来计算NCR活性。

自备仪器和用品：

普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：粉剂×2瓶，4℃保存。临用前根据用量每瓶加100mL蒸馏水充分溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1管，-20℃保存。临用前配制，加1.04 mL蒸馏水充分溶解，4℃保存。

试剂四：粉剂×1管，4℃保存。临用前配制，加1100 μL蒸馏水充分溶解，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去细胞核和线粒体等：称约0.5g组织，加入4℃预冷的1 mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1 mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。

NADPH-细胞色素C还原酶测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到550 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在37℃水浴中预热30min。

3. 空白管：取微量石英比色皿/96孔板，依次加入10μL蒸馏水、180μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10s和第130s吸光值。△A空白管=A2-A1。

4. 测定管：取微量石英比色皿/96孔板，依次加入10μL提取液、180μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10s和第130s吸光值。△A测定管=A4-A3。

注意：空白管只需做一次。

NCR活性计算公式公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。

NCR ((nmol/min /mg prot)= (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷（Cpr×V样）÷T

= 550×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃中，每克组织每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。

NCR ((nmol/min/g 鲜重)= (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T

=275×(△A测定管-△A空白管)÷W

ε：还原型细胞色素C摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；V反总：反应体系总体积（L），210μL=2.1×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），10μL=0.01mL；V样总：提取液体积，0.5 mL；T：反应时间（min），2min 。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。

NCR ((nmol/min/mg prot)= (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷（Cpr×V样）÷T

= 1100×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃中，每克组织每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素c为1个酶活单位。

NCR ((nmol/min/g 鲜重) = (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T

= 550×(△A测定管-△A空白管)÷W

ε：还原型细胞色素C摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：96孔板光径（cm），0.5cm；V反总：反应体系总体积（L），210μL=2.1×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），10μL=0.01mL；V样总：提取液体积，0.5mL；T：反应时间（min），2min 。

注意事项：

试剂三、试剂四临用前配制，配好未使用完的4℃可保存两天。