人类多能干细胞完全培养基

人类多能干细胞完全培养基

产品货号：Cat.No.:AC-1001001

产品基本信息

产品简介

人类多能干细胞（ES/iPS）完全培养基是埃泽思生物科技有限公司（Applied Cell^TM）自主研发的一款适用于无滋养层培养，无血清、化学成分明确，广泛用于人类胚胎干细胞(ES细胞)和诱导多能干细胞(iPS细胞)培养的完全培养基。该产品适用于Essential 8系统和mTeSR系统培养的，可应用于干细胞传代，内含干细胞保护因子，防止细胞的凋亡、分化，对细胞具有良好的保护作用。GMP级别生产车间，严格执行cGMP操作标准，各项指标优于行业标准。

产品特性

l 成分明确，批间差小

l 无需滋养层细胞

l 内含干细胞保护因子，防止干细胞的凋亡、分化

l 适用于E8系统和mTeSR系统培养的人类多能干细胞

产品内容

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即用型基质胶（Applied Cell^TM: AC-1001007）

人类多能干细胞无酶消化液（Applied Cell^TM: AC-1001008）

Serum-Free干细胞高效冻存液（Applied Cell^TM: AC-1001011/AC-1001012）

实验准备

人类多能干细胞完全培养基配制

1）2-8℃解冻hPSC Complete Medium Supplement，解冻后轻摇混匀，按实际用量进行分装，立即使用或储存于-20~ -80℃，避免反复冻融；

2）按1:4比例将添加剂加入到hPSC Complete Medium Basal Medium中(100ml添加剂加入400ml基础培养基中)，混合均匀即为人类多能干细胞完全培养基（AC-1001001）。人类多能干细胞完全培养基可在2-8℃稳定储存2周，不建议使用配制已超过2周的人类多能干细胞完全培养基。

3）人类多能干细胞完全培养基（AC-1001001）可直接应用于人类多能干细胞的传代、扩增培养，具体操作方法及其他相关技术资料请参考埃泽思生物官网。

操作方法(以下步骤皆应在无菌条件下操作)

hPSC细胞复苏

1. 实验前准备工作：

1.1  基质胶铺板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，每孔内加入1 mL/0.5 mL即用型基质胶（AC-1001007），轻轻晃动6孔板/12孔板使基质胶完全覆盖皿底，然后置于37℃，5% CO₂培养箱中孵育1h~2h，在实验前拿出并置于超净工作台/生物安全柜中室温下平衡20min或2-8℃静置过夜备用。如果暂时不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 储存，并于1周内使用。

注意：①干细胞复苏过程中的基质胶铺板数由冻存细胞密度决定，一支冻存的干细胞的密度在1×10⁶cells/mL左右，需要6孔板铺1孔或12孔板铺2孔基质胶；②即用型基质胶受热易发生沉淀，即用即拿及时放回4℃冰箱保存且勿用手直接触碰基质胶液面所及的瓶身，防止生成沉淀，影响基质胶质量。

1.2  实验试剂平衡：人类多能干细胞完全培养基（AC-1001001）在实验前置于室温中避光平衡30min~1h。

1.3  超净工作台/生物安全柜照射紫外：在实验前打开紫外灯照射30min进行灭菌。

1.4  恒温水浴锅准备：水浴锅温度设置在37℃用于hPSC细胞复苏。

2. 实验具体操作步骤：

2.1  提前加入人类多能干细胞完全培养基（AC-1001001）：复苏前，先在15mL离心管中加入2~3mL的人类多能干细胞完全培养基（AC-1001001）备用。

2.2  解冻：将从液氮中取出的冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动，使其在1~2min内快速解冻；

注意：细胞从液氮中拿出的速度要快，尽量减少其暴露在室温中的时间。

2.3  离心：冻存管中的冻存液解冻后，将其吸出并缓慢逐滴滴入提前在15mL离心管中加入的人类多能干细胞完全培养基（AC-1001001）中，将15mL离心管置于低速离心机中配比平衡后，1000rpm/min离心3min；

2.4  重悬：离心后弃上清，加入1mL人类多能干细胞完全培养基（AC-1001001）对干细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸3~5次左右。

2.5  接种：吹吸均匀后，将已经平衡好的基质胶弃掉，缓慢吹吸15mL离心管中的细胞悬液，缓慢吹吸3~5次，待细胞悬液混匀后，加入到6孔板/12孔板中铺胶的孔内，且补全每孔2 mL/1 mL的培养体系。

2.6  培养：接种后的6孔板/12孔板可以置于倒置相差显微镜下观察接种的干细胞密度以及细胞团块大小，呈4个细胞以上的团块较合格，水平十字轻轻晃动6孔板/12孔板使细胞均匀分布。并置于37℃，5% CO₂的恒温培养箱培养，第2天观察细胞贴壁情况；

2.7  换液：从复苏的时间开始每24h换液一次。

注意：因培养基中活性成分只足够维持一天，所以每24h应及时更换新鲜培养基。

hPSC细胞传代

1. 实验前准备工作：

1.1  基质胶铺板、孵育及平衡：同hPSC细胞复苏中基质胶铺板、孵育及平衡操作步骤。

1.2  实验试剂平衡：人类多能干细胞完全培养基（AC-1001001）、人类多能干细胞无酶消化液（AC-1001008 ）以及PBS缓冲液在实验前置于室温中避光平衡30min~1h。

1.3  超净工作台/生物安全柜照射紫外：在实验前打开紫外灯照射30min进行灭菌。

2.  实验具体操作步骤：

2.1  清洗：拿出6孔板/12孔板弃去旧的人类多能干细胞完全培养基（AC-1001001），贴壁缓慢加入1 mL/0.5 mL PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去 PBS缓冲液；

2.2  消化：在6孔板/12孔板中加入1 mL/0.5 mL人类多能干细胞无酶消化液（AC-1001008）使之覆盖皿底，并置于CO₂培养箱中2~5 min；

注意：消化时间依据干细胞生长密度，如果密度中等且培养2~3天，消化时间可以控制在2 min~3min，若密度很大且培养4天以上消化时间可以控制在3 min~5min，消化时间快结束时可以拿到倒置显微镜下观察细胞消化情况，若在显微镜下观察到大部分克隆边缘以及克隆内部细胞间出现间隙，即刻吸掉无酶消化液停止消化。

2.3  吹打：吸掉人类多能干细胞无酶消化液（AC-1001008）后，立刻加入平衡好的2mL/1mL干细胞完全培养基（AC-1001001），用移液枪扇形吹打培养皿底，吹吸次数保持在3~5次，使皿底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液，并将其并转移到15mL离心管中；

注意：吹吸皿底细胞的力度要轻柔，吹打脱落和吹吸混匀的次数在3~5次为宜，尽量避免形成单细胞。如有少量细胞无法从皿底脱落，属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落，需延长消化时间。

2.4  接种：待皿底的细胞全部吹下并加入到15mL离心管后，将已经平衡好的即用型基质胶（AC-1001007）弃掉，缓慢吹吸15mL离心管中的细胞悬液，缓慢吹吸1~2次，待细胞悬液混匀后，加入到6孔板/12孔板中铺胶的孔内，且补全每孔2mL/1mL的培养体系。

2.5  培养：同hPSC细胞复苏中培养操作步骤；

2.6  换液：从传代的时间开始每24h换液一次。

注意：因培养基中活性成分只足够维持一天，所以每24h应及时更换新鲜培养基。

hPSC细胞冻存

1. 实验前准备工作：

1.1  实验试剂平衡： 人类多能干细胞完全培养基（AC-1001001）、人类多能干细胞无酶消化液（AC-1001008）以及PBS缓冲液在实验前置于室温中避光平衡30min~1h。

1.2  超净工作台/生物安全柜照射紫外：在实验前打开紫外灯照射30min进行灭菌。

2. 实验具体操作步骤：

2.1  清洗：拿出6孔板/12孔板弃去旧的人类多能干细胞完全培养基（AC-1001001），贴壁缓慢加入2mL/1mL PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去 PBS缓冲液；

2.2  消化：同hPSC细胞传代中消化操作步骤；

2.3  吹打：同hPSC细胞传代中吹打操作步骤；

2.4  离心：待皿底的细胞全部吹下并加入到15mL离心管后，将15mL离心管置于低速离心机中配比平衡后，1000 rpm/min离心3 min；

2.5  重悬：离心后弃上清，加入1 mL Serum-free干细胞高效冻存液（AC-1001011/AC- 1001012）对干细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸3~5次后，将其加入到1.8mL冻存管中；

注意：冻存液即用即拿，及时放回4℃冰箱。通常生长状态相同且同时消化的细胞统称为一批细胞。

2.6  记录：在冻存管上标记冻存细胞种类、时间、操作者及细胞批次。

2.7  -80℃冰箱平衡：冻存管置于-80℃冰箱过夜。

 注意：冻存管放置于-80℃冰箱时，要将冻存管直立放置，切忌冻存管斜放或横放。

2.8  液氮冻存：冻存管置于 -80℃冰箱过夜后，第2天将其置于液氮中进行长期保存。

细胞形态图

质量控制