在ELISA实验操作中,洗涤是一大重点步骤.这一流程主要作用是可降低未结合抗体所引起的背景信号,从而增加分析的信噪比.每一步之间的洗涤确保只有特异的结合事件被保留,在最后一步产生信号.但是,不充分的洗涤会导致差异和高背景,从而带来不理想的结果.那么在ELISA洗涤步骤中需要怎样正确操作呢？需要洗涤几次？
据酶联免疫学第三方检测中心技术专员介绍：ELISA通常在96孔板中开展,其上包被了结合抗原或抗体.在封闭步骤后,包被后的平板首先与一抗或抗原孵育.随后通过一些洗涤步骤去除未结合(低亲和力)的抗原-抗体复合物.接着,平板与二抗孵育.这种带有酶的抗体与高亲和力的抗原-抗体复合物结合.之后,又是一轮洗涤.最后是添加底物并检测信号.
洗涤次数越多,背景越低.然而,太多次的洗涤会降低信号强度,使其难以测定.通常的做法是在每次抗体或抗原孵育后重复洗涤三次.不过,ELISA板的制造商会对洗涤次数提出建议.一般而言,制造商包被平板需要的洗涤次数比用户包被的平板要少.对于用户包被的ELISA板,必须优化洗涤次数.
控制洗涤量和洗涤次数的另一种方法是加入过量的洗涤液.一般来说,96孔板的每个孔能容纳330至460 μl.不过,有些自动化洗板机可设置程序,分配远远超出这个量的洗涤液,比如1ml.它是如何做到的呢？其实很简单,就是在分液的同时打开吸液功能.换句话说,随着分液器分配更多的液体,抽吸器也将液体吸出.这种技术能增加洗涤量,但不会溢出到其他孔中.
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